A biopreservação por bactérias ácido-láticas (BAL) e seus metabólitos constitui uma estratégia promissora para o controle de patógenos. O queijo Minas Frescal, produto de relevância socioeconômica em Minas Gerais, apresenta elevada umidade e composição nutricional que favorecem o crescimento de Listeria monocytogenes. O estudo avaliou o potencial bioprotetor de onze BAL, isoladas de leite cru de queijarias mineiras. As cepas foram testadas quanto atividade antagonista frente a L. monocytogenes ATCC 7644, atividade proteolítica e capacidade de acidificação. Os halos de antagonismo variaram de 3,5 a 5,5 mm; os halos de proteólise de 0 a 9 mm; e o pH (após 48 h) variou de 4,71 a 6,55. Quatro isolados, sem atividade proteolítica e com capacidade de acidificação limitada foram selecionados como promissores; entre eles, o isolado ITA_bac_1 foi levado a ensaio de co-cultivo com L. monocytogenes em Skim Milk 10%. Contudo, o co-cultivo não apresentou inibição, independentemente da concentração celular da BAL testada (3, 5 e 7 log UFC/ mL). Os resultados indicam que o antagonismo in vitro não garante a mesma atividade na matriz láctea líquida devido ao efeito de diluição e capacidade tamponante do meio, exigindo estudos para viabilizar sua aplicação.