A quantificação de tecidos lignificados em colmos de cana-de-açúcar é relevante para a caracterização anatômica da biomassa e para sua avaliação em diferentes finalidades de uso. Este estudo teve como objetivo desenvolver e avaliar métodos automatizados de segmentação de imagens histológicas de colmos de cana-de-açúcar, comparando dois pipelines baseados no canal de Saturação (S) do espaço HSV e no índice de Excesso de Vermelho (ExR). Secções do terço médio dos entrenós foram submetidas ao teste de Wiesner com floroglucinol, e as imagens foram obtidas em estereomicroscópio. O processamento foi realizado em Python, utilizando OpenCV e NumPy, com etapas de pré-processamento, limiarização pelo método de Otsu, operações morfológicas e quantificação automática dos pixels segmentados. Os resultados foram comparados às quantificações obtidas no ImageJ. Ambos os métodos apresentaram elevada associação linear com a referência, com coeficientes de determinação superiores a 0,99. Entretanto, o canal S superestimou sistematicamente as regiões lignificadas, com erro relativo médio de 20,2%. O ExR apresentou maior correspondência com o ImageJ, com diferenças relativas entre -2,5% e 3,1% e erro absoluto médio de 2,34%. Assim, o ExR demonstrou maior precisão e potencial para automatizar a quantificação de tecidos lignificados em imagens histológicas de cana-de-açúcar de forma objetiva e padronizada.
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